摘要：建立克拉霉素微生物限度檢查方法。根據(jù)試驗結(jié)果，克拉霉素對細(xì)菌抑菌作用強，特別是金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，必須采用均質(zhì)袋并通過薄膜過濾法去除克拉霉素的抑菌作用，各試驗菌的回收率達到50%以上。該方法可用于克拉霉素微生物限度檢查。

       克拉霉素為屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對革蘭陽性菌，部分革蘭陰性菌及支原體有抑制作用，臨床主要用于抗感染治療。《中國藥典》2020年版規(guī)定，1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法用于檢查非無菌制劑及其原輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。本文采用五種菌作為陽性對照菌，測其回收率，建立克拉霉素微生物限度檢查方法。

       1.試驗材料和儀器

       1.1供試樣品：克拉霉素，批號：A、B、C

       1.2培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號：20220614，廠家：青島日水生物技術(shù)有限公司；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號：20221125，廠家：青島日水生物技術(shù)有限公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號：202308703，廠家：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號：20210914，廠家：青島日水生物技術(shù)有限公司；pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，批號：20230323，廠家：青島日水生物技術(shù)有限公司；0.9％無菌氯化鈉溶液：批號：2304011301，廠家：石家莊四藥有限公司。

       1.3試驗菌種：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。

       1.4儀器：鑫貝西生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X；永生生化培養(yǎng)箱SHH-500L。

       2.需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

       克拉霉素為抗生素類藥物，具有較強的抑菌活性，根據(jù)《中國藥典》2020年版1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查，本品采用薄膜過濾法進行試驗。

       2.1菌液制備

       取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)18～24h；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)2～3d。上述培養(yǎng)物用0.9％無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，經(jīng)23℃培養(yǎng)5～7d，加入3～5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，將霉菌孢子洗脫，然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。各試驗菌的接種量不大于100cfu。

       2.2供試液的制備

       取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，制成10^-1供試液。取10^-1供試液10ml，加入pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，制成10^-2供試液，取10^-1供試液10ml，加入pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，制成10^-3供試液。

       2.3薄膜過濾法（常規(guī)方法）

       2.3.1試驗組：取10^-2供試品10ml，分別加入各試驗菌（不超過100cfu）混勻，進行薄膜過濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml。

       2.3.2菌液組：以稀釋劑代替供試液，按試驗組操作加入各試驗菌。

       2.3.3供試品對照組：取10^-2供試品10ml，以稀釋劑代替菌液同試驗組操作。

       2.3.4試驗菌回收率的計算：

       回收率=[（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液組菌落數(shù)]×100%

       2.3.5結(jié)果判斷：試驗菌回收率不低于50%，符合驗證試驗，可按照此方法進行需氧菌、霉菌和酵母菌的微生物計數(shù)，若試驗菌回收率低于50%，應(yīng)消除供試品的抑菌性，并重新進行方法實驗。

       2.3.6克拉霉素通過薄膜過濾法，需氧菌總數(shù)檢查試驗菌回收率結(jié)果，見表1；霉菌和酵母菌總數(shù)檢查試驗菌回收率結(jié)果，見表2。

       表1 需氧菌總數(shù)檢查方法試驗菌回收率（薄膜過濾法）

       表2 霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法試驗菌回收率（薄膜過濾法）

       由表2所示，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于50%，此方法適用于霉菌和酵母菌計數(shù)，但是由表1可以看出，雖然白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于50%，而金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的回收率為0%。由此可見，克拉霉素對細(xì)菌有較強的抑菌作用，應(yīng)建立新的方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行試驗。

       2.4薄膜過濾法（采用高稀釋級別供試液并采用不同沖洗量）

       2.4.1試驗組：取10^-3供試品10ml，加入試驗菌（不超過100cfu）混勻，進行薄膜過濾，采用0.1%蛋白胨水溶液沖洗，每次沖洗量為100ml，總沖洗量分別為300ml、500ml、800ml。

       2.4.2菌液組、供試品對照組均同法操作。

       2.4.3克拉霉素薄膜過濾法（采用高稀釋級別供試液并采用不同沖洗量），細(xì)菌試驗菌回收率結(jié)果，見表3。

       表3細(xì)菌試驗菌回收率（采用高稀釋級別供試液并采用不同沖洗量）

       由表3所示，采用最高的稀釋級別10^-3供試液10ml進行薄膜過濾，沖洗量為300ml，銅綠假單胞菌的回收率在50%以上；而總沖洗量為800ml時，金黃色葡萄球菌回收率僅為20.6%，枯草芽孢桿菌的回收率為40.5%，仍低于50%，需要重新建立方法進行驗證。由此可見，克拉霉素對細(xì)菌抑菌作用強，特別是金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。

       2.5薄膜過濾法（采用均質(zhì)袋）

       2.5.1供試液的制備：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，并置含濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中，使分散均勻，制成10^-1供試液。取10^-1供試液10ml，加入pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，制成10^-2供試液。依上述方法制成10^-3供試液。

       2.5.2試驗組：取10^-3供試品10ml，加入500mlpH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，再分別加入試驗菌（不超過100cfu）混勻，進行薄膜過濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml。

       2.5.3菌液組、供試品對照組均同法操作。

       2.5.4克拉霉素通過薄膜過濾法（采用均質(zhì)袋），需氧菌總數(shù)檢查方法試驗菌回收率結(jié)果，見表4。

       表4需氧菌總數(shù)檢查方法試驗菌回收率（薄膜過濾法采用均質(zhì)袋）

       由表4所示，采用均質(zhì)袋，聯(lián)合薄膜過濾法，各試驗菌的回收率均高于50%，說明此方法消除供試品的抑菌活性，因此可采用均質(zhì)袋并通過薄膜過濾法進行克拉霉素的需氧菌計數(shù)。

       3.控制菌檢查方法的驗證

       3.1供試液的制備：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，并置含濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中，使分散均勻，制成10^-1供試液。

       3.2試驗組：取10^-1供試品10ml，加入500mlpH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，再加入大腸埃希菌（不超過100cfu）混勻，進行薄膜過濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml，抽濾，取濾膜至400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,33℃培養(yǎng)18～24小時，依法檢查。

       3.3陽性對照組：取不超過100cfu大腸埃希菌至400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法檢查。

       3.4陰性對照組：以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)的控制菌檢查法檢查。

       3.5試驗結(jié)果：試驗組、陽性對照組檢出大腸埃希菌，陰性對照組未檢出大腸埃希菌。

       4 結(jié)果

       根據(jù)上述試驗結(jié)果，克拉霉素的微生物限度檢查采用下列方法，取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，并置含濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中，使分散均勻，制成10^-1供試液，依次制成10^-2、10^-3供試液，需氧菌總數(shù)：取10-3供試品10ml，加入500mlpH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，進行薄膜過濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml；霉菌和酵母菌總數(shù)：取10-2供試品10ml，進行薄膜過濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml；控制菌檢查：取10-1供試品10ml，加入500mlpH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，進行薄膜過濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml，取濾膜至400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，依法檢查大腸埃希菌。

       5 討論

       微生物的生長受許多因素的影響，特別的藥品中污染的微生物。一些藥物自身具有抑菌作用，因此建立其微生物限度檢查方法時，應(yīng)考慮采用適合的方法消除供試品的抑菌活性。克拉霉素對細(xì)菌具有較強的抑菌作用，本文試驗供試品制備時，采用含濾網(wǎng)的均質(zhì)袋，使藥品分散均勻，吸取供試液加入到稀釋劑中，再進行薄膜過濾，并沖洗，聯(lián)合作用下去除了克拉霉素的抑菌活性，提高了克拉霉素微生物污染菌的檢出。

       作者簡介：@昔年，檢驗員，從事藥品檢驗工作六年，對工作積極熱情，期待自己能在本職崗位不斷進步，放光發(fā)熱。

       參考文獻

       [1] 中國藥典[S].四部,2020;通則1105、1106

       [2] 楊薇. 鹽酸西替利嗪片微生物限度檢查方法的建立[J].中國保健營養(yǎng),2017, 27(17);116-117