雙特異性抗體（bsAbs）簡(jiǎn)直是生物界的 "雙面間諜"，憑借一手 "左右開(kāi)弓" 的結(jié)合絕技圈粉無(wú)數(shù)。它能同時(shí)盯上兩個(gè)抗原靶點(diǎn)，搞出 1+1>2 的協(xié)同效果，連傳統(tǒng)單特異性抗體組隊(duì)都得甘拜下風(fēng)。不過(guò)這位 "潛力股" 的成長(zhǎng)之路可不順，設(shè)計(jì)構(gòu)建時(shí)總被各種麻煩絆住腳 -- 誰(shuí)讓它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜度比傳統(tǒng)抗體高出好幾個(gè)段位呢。這些麻煩五花八門(mén)：外源抗原結(jié)合域一融合，生物物理穩(wěn)定性就掉鏈子；抗體鏈還總愛(ài) "錯(cuò)點(diǎn)鴛鴦譜"，結(jié)果生出些難以清除的 "雜質(zhì)寶寶"。想讓 bsAbs 既有預(yù)期的 "超能力"，又具備優(yōu)秀的 "藥界潛質(zhì)"，就得在設(shè)計(jì)時(shí)精打細(xì)算，再給它來(lái)一輪全方位的分子工程 "改造升級(jí)"。本文就來(lái)好好嘮嘮 bsAbs 設(shè)計(jì)里的那些關(guān)鍵考量，以及能高效打造不同分子形態(tài) bsAbs 的先進(jìn)工程原理。

       簡(jiǎn)介

       近年來(lái)，雙特異性抗體（bsAbs）在治療界可謂 "C 位出道"，為靶向治療打開(kāi)了一扇新大門(mén)。它有個(gè)獨(dú)門(mén)絕技 -- 能同時(shí)對(duì)兩個(gè)不同靶點(diǎn) "下手"，從而協(xié)同靶向疾病通路，這可是傳統(tǒng)免疫球蛋白組合想都不敢想的操作。雖說(shuō)治療性 bsAbs 是人工工程的 "杰作"，但在自然界也能偶爾撞見(jiàn)它們的身影，比如通過(guò) IgG4 半分子的 Fab 臂交換形成的那種。

       工程 bsAbs 的結(jié)合 "十八般武藝"，讓人們對(duì)它在多種疾病中的應(yīng)用浮想聯(lián)翩，癌癥、自身免疫性疾病、傳染病都可能被它攻克。最近有篇文章更是把雙特異性和多特異性藥物封為 "療法新勢(shì)力"。bsAb 的治療潛力讓這個(gè)領(lǐng)域成了 "香餑餑"，競(jìng)爭(zhēng)那叫一個(gè)白熱化，但也催生出不少腦洞大開(kāi)的工程奇跡，看看臨床階段 bsAb 五花八門(mén)的分子形態(tài)就知道了。

       作用機(jī)制

       bsAbs 的雙重結(jié)合能力，讓它的作用機(jī)制（MOA）比傳統(tǒng)單克隆抗體復(fù)雜得多，簡(jiǎn)直像個(gè)精密的 "生物鐘表"。對(duì)很多 bsAbs 來(lái)說(shuō)，想要發(fā)揮作用，兩個(gè)結(jié)合事件得在特定時(shí)間和空間 "約會(huì)"。也就是說(shuō)，兩種結(jié)合特異性不僅得按特定物理排列 "站位"（比如把兩個(gè)靶標(biāo)拉得近近的，誘導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)），還得講究 "時(shí)機(jī)"（比如同時(shí)連接細(xì)胞，或者按順序靶向跨越屏障）。

       有些 bsAbs 的作用機(jī)制，光靠?jī)蓚€(gè)親本抗體 "組隊(duì)" 根本搞不定，這種就被稱(chēng)為 "專(zhuān)性 bsAbs"。但就算沒(méi)有這種 "非它不可" 的機(jī)制，bsAbs 往往也不只是簡(jiǎn)單的 "零件拼接"，效力常常比親本抗體組合強(qiáng)得多。據(jù)推測(cè)，這可能是沾了親和力的 "光"。

       雙重靶向還能提高靶標(biāo)選擇性和定位精度，從而減少副作用，對(duì)于避免 "誤傷友軍"（也就是 "在靶、脫瘤" 效應(yīng)）特別有用。就算 bsAb 的活性和親本抗體組合差不多，它在生產(chǎn)上也有優(yōu)勢(shì) -- 畢竟只需要生產(chǎn)一個(gè)分子，省事兒多了。

       BsAb 的雙靶向活性大致能分為 "順式" 和 "反式" 兩類(lèi)。能不能把特定抗原結(jié)合域巧妙 "混搭"，針對(duì)性地作用于相同（順式）或不同（反式）的細(xì)胞 / 分子靶點(diǎn)，直接決定了 BsAb 能不能發(fā)揮協(xié)同功能。

       反式作用的 BsAbs 就像 "紅娘"，專(zhuān)找不同的靶點(diǎn) "牽線(xiàn)搭橋"，形成物理連接。要是它結(jié)合的是不同細(xì)胞靶點(diǎn)，那作用機(jī)制就全靠把兩種細(xì)胞 "綁" 在一起，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間 "搭橋"。雙特異性 T 細(xì)胞銜接子就是個(gè)典型例子，它一邊勾搭腫瘤相關(guān)抗原，一邊聯(lián)系 CD3（一種超強(qiáng)共刺激受體），成功讓 T 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞 "見(jiàn)面"（圖 1A）。這貨還能繞過(guò) T 細(xì)胞的自然活化流程，通過(guò)聚集低親和力 T 細(xì)胞受體，直接把 T 細(xì)胞 "騙" 到表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞那兒去。

       "非反式" 這個(gè)詞在分子層面也有用武之地，比如雙互補(bǔ)位抗 HER2 bsAb，它結(jié)合的是兩個(gè)不同的 HER2 分子（非反式），而不是同一個(gè)（順式）。這種交叉結(jié)合能把相鄰分子連起來(lái)，誘導(dǎo) HER2 發(fā)生不一樣的重組，還能引發(fā)補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性，這可是單特異性抗 HER2 抗體組合做不到的。這種分子非反式結(jié)合，主要和那些靶向同一抗原上不同且不重疊表位的雙互補(bǔ)位 bsAb 有關(guān)。

       順式作用的 bsAb 則像 "同小區(qū)保安"，主要盯著同一細(xì)胞上的抗原（圖 1B、C）。能激活同一細(xì)胞表面兩個(gè)受體的激動(dòng)劑 bsAb（細(xì)胞順式激活），可以通過(guò)精確控制受體亞基 "牽手" 來(lái)選擇性調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)。比如有個(gè)靶向白介素（IL）-2 受體亞基 IL-2Rβ 和 IL-2Rγ 的 bsAb，它能通過(guò)中等親和力的 IL-2Rβγ 增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)削弱高親和力 IL-2Rαβγ 的信號(hào)。還有個(gè)靶向死亡受體（DR）4 和 5 的雙重激動(dòng)劑雙特異性 Surrobody，效力比親本抗體組合強(qiáng)，可能是因?yàn)樗茏?DR4 和 DR5 "抱團(tuán)" 形成異二聚體。

       另一種順式激活 bsAbs 被稱(chēng)為 "輔因子模擬器"，主要作用是幫酶和它的 "專(zhuān)屬底物" 找準(zhǔn)位置（圖 1F）。凝血因子 FVIIIa 模擬物就是這么個(gè)角色，能促進(jìn) FIXa 和 FX "相遇"。這倆一旦 "組隊(duì)"，就會(huì)生成活化因子 Xa（FXa），這可是凝血途徑的關(guān)鍵 "推手"，所以這類(lèi) bsAb 和血友病 A 的治療關(guān)系密切。對(duì)于那些產(chǎn)生了抗 FVIII 同種抗體的患者來(lái)說(shuō)，重組 FVIII 治療基本沒(méi)用，這種 bsAb 輔因子模擬物可就成了 "救星"。

       圖 1. bsAb的特異性作用機(jī)制。(A)反式細(xì)胞橋接通過(guò) bsAb 在不同細(xì)胞之間建立了物理連接。該機(jī)制尤其適用于 T 細(xì)胞重定向 bsAb，因?yàn)檫@種物理連接有助于靶向激活 T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。(B)受體的順式橋接引起激動(dòng)劑交聯(lián)，并激活相關(guān)的受體信號(hào)傳導(dǎo)。(C)順式拮抗作用阻斷受體結(jié)合，從而阻止信號(hào)通過(guò)受體復(fù)合物進(jìn)行傳導(dǎo)。(D)搭載型 bsAb 利用一種特異性靶向受體，該受體有助于跨膜轉(zhuǎn)位到原本無(wú)法進(jìn)入的區(qū)室，而另一種特異性則在此發(fā)揮其功能。閃電表示由抗體結(jié)合介導(dǎo)的活性。(E) BsAb可以發(fā)揮定位效應(yīng)。例如，激動(dòng)劑 bsAb也具有腫瘤靶向特異性，通過(guò)將激動(dòng)劑機(jī)制限制在腫瘤標(biāo)志物存在的位點(diǎn)，限制了靶向、非腫瘤效應(yīng)。(F) BsAbs通過(guò)準(zhǔn)確定位酶和底物充當(dāng)輔助因子模擬物。

       也可以用拮抗性 bsAb 來(lái) "搗亂" 信號(hào)通路，它們會(huì)霸占細(xì)胞受體，不讓可溶性受體配體 "靠近"。這類(lèi)拮抗性 bsAb 常被用來(lái)阻斷免疫檢查點(diǎn)受體，這可是抗癌免疫治療里的 "明星靶點(diǎn)"。比如雙重阻斷免疫檢查點(diǎn)通路，或者同時(shí)盯上免疫檢查點(diǎn)和抗腫瘤免疫的負(fù)調(diào)節(jié)因子（像與不良預(yù)后相關(guān)的 TGF-β）。

       順式作用的拮抗性 bsAb 還能靶向相關(guān)或重疊的信號(hào)通路。所以這類(lèi) bsAb 可以一邊對(duì)付原發(fā)性癌癥相關(guān)通路，一邊處理那些可能因?yàn)樵l(fā)通路被阻斷而 "冒頭" 的相關(guān)通路，從而阻止癌細(xì)胞 "逃之夭夭"。HER2xHER3 雙特異性抗體就是個(gè)例子，HER3 的上調(diào)可是 HER2 抑制劑耐藥的 "罪魁禍?zhǔn)?quot;。

       激動(dòng)劑型 BsAbs 的發(fā)現(xiàn)可比拮抗性的難多了，畢竟抗體的激動(dòng)活性受一堆難以捉摸的因素影響。比如有研究發(fā)現(xiàn)，激動(dòng)劑型抗 CD3 BsAbs 的細(xì)胞毒活性就和親和力、表位、分子幾何形狀脫不了干系。相比之下，有效的拮抗劑通常只要親和力高，能和天然配體 "搶位置" 阻斷其作用就行。另外，把 BsAbs 組合起來(lái)還能獲得治療效應(yīng)機(jī)制的額外協(xié)同效果，不過(guò)這可能會(huì)讓作用機(jī)制更復(fù)雜，給 BsAb 設(shè)計(jì)再添點(diǎn) "麻煩"。

       Fc 的作用

       所有天然抗體都帶著個(gè) "功能小助手"--Fc 區(qū)，它對(duì)抗體的效應(yīng)功能至關(guān)重要，通過(guò)和同源 Fc 受體以及補(bǔ)體蛋白等可溶性免疫介質(zhì)結(jié)合，觸發(fā)宿主細(xì)胞反應(yīng)。對(duì) Fc 蛋白和糖進(jìn)行 "改造"，能消除或大幅增強(qiáng) Fc 介導(dǎo)的效應(yīng)功能，比如 NK 細(xì)胞的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用（ADCC）、巨噬細(xì)胞的抗體依賴(lài)性細(xì)胞吞噬作用（ADCP），甚至某些 CD8 T 細(xì)胞反應(yīng)。

       人們?cè)谠O(shè)計(jì)傳統(tǒng)單特異性抗體的 Fc 區(qū)上花了不少功夫，就是為了讓它具備天然同種型沒(méi)有的效應(yīng)功能（或者去掉某些功能）。比如給 IgG1 抗體加個(gè) FcγR 沉默突變，就能造出效應(yīng)子減少的版本，但還保留著 IgG1 的優(yōu)良特性。反過(guò)來(lái)，搞搞糖工程，比如給 Fc-IgG1 N - 糖去掉核心巖藻糖，或者做點(diǎn)突變，能增強(qiáng)和某些 Fc受體的結(jié)合，從而提升效應(yīng)功能，像 FcγRIIIa 介導(dǎo)的 ADCC 或 ADCP。這些效應(yīng)調(diào)節(jié)突變或糖工程，通常和 bsAb 常見(jiàn)的突變（比如用于鏈轉(zhuǎn)向的突變）不沖突，所以在含 Fc 的 bsAb 里也能組合使用。

       根據(jù)預(yù)期的藥理作用（MOA），有些 BsAb 可能更適合 "改造" Fc 區(qū)，有些則完全不用動(dòng)。臨床開(kāi)發(fā)的 BsAb 大多都帶著 Fc 區(qū)，畢竟這個(gè)結(jié)構(gòu)域能用 Protein A輕松純化，而且 FcRn 循環(huán)還能延長(zhǎng)半衰期。含 Fc 區(qū)的 BsAb 根據(jù)分子幾何結(jié)構(gòu)，大概能分成對(duì)稱(chēng)型和非對(duì)稱(chēng)型。

       雖說(shuō) Fc 區(qū)改造技術(shù)挺成熟，但有時(shí)候，基于小片段的 bsAb 比大型 IgG 樣 bsAb 更有優(yōu)勢(shì)?；谄蔚?bsAb 通常是把獨(dú)立抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)基因融合 "拼" 出來(lái)的，也能用多聚化結(jié)構(gòu)域組裝。這種方法的好處是，產(chǎn)物通常個(gè)頭小，還沒(méi)有重要的糖基化位點(diǎn)，用細(xì)菌或酵母這類(lèi)簡(jiǎn)單表達(dá)系統(tǒng)就能高產(chǎn)。

       基于片段的 BsAb 通常就一兩條多肽鏈，大大降低了因鏈錯(cuò)配產(chǎn)生 "雜質(zhì)寶寶" 的風(fēng)險(xiǎn)，這可是那些個(gè)頭大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的 BsAb 常遇到的頭疼事。而且，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)簡(jiǎn)單基因融合，在價(jià)態(tài)和特異性組合上特別靈活，比如能搞出 1+3 和 3+3 的 BsAb 形式。

       傳統(tǒng)上，不含 Fc 區(qū)的基于片段的 bsAbs 多是用 scFv 片段做的，把它們以不同方式組合，能形成 BiTE、TandAb 或 DART 分子，這些都是 scFv 基片段 bsAbs 的主要類(lèi)型（圖 2A）。不過(guò) scFv 片段常有點(diǎn) "小脾氣"，熱力學(xué)不穩(wěn)定，還愛(ài)搞 VH-VL 錯(cuò)配，結(jié)果生成不想要的自組裝產(chǎn)物。

       scFv 的這些 "毛病" 讓人們把目光投向了單域抗體（sdAbs）。sdAbs 也是小個(gè)子（約 15 kDa）的抗原結(jié)合域，能通過(guò)基因融合形成基于片段的 bsAbs，而且它穩(wěn)定又結(jié)實(shí)，本質(zhì)上是單體，不容易發(fā)生不良自組裝。把 sdAbs 分別融合到 CH1 和 Cκ 上，不用接頭也能組合，借助恒定結(jié)構(gòu)域的自然配對(duì)作為二聚化基序，就能生成小的 Fab 樣 bsAbs。當(dāng)然啦，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的組合方式還有很多，遠(yuǎn)不止上面說(shuō)的這些。

       基于片段的 bsAb 有個(gè)潛在 "短板"-- 個(gè)頭小又沒(méi)有 FcRn 結(jié)合區(qū)，所以清除得快。不過(guò)在某些應(yīng)用和形式中，這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)得到解決，比如把 bsAb 和 HSA 偶聯(lián)，或者加個(gè)抗 HSA 抗體片段。

       圖 2 .根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分類(lèi)的最常見(jiàn) bsAb形式的示意圖。（A）基于片段的 bsAb 是由不帶 Fc 結(jié)構(gòu)域的小抗原結(jié)合片段組合而成。其構(gòu)建單元通常是 scFv 片段或 sdAb。（B）對(duì)稱(chēng) Fc 結(jié)構(gòu) bsAb 由一到兩條多肽鏈表達(dá)，通常通過(guò)將額外的抗原結(jié)合片段融合到 IgG 骨架上來(lái)實(shí)現(xiàn)。（C）不對(duì)稱(chēng) Fc 結(jié)構(gòu) bsAb 由兩到四條多肽鏈組裝而成。不對(duì)稱(chēng) bsAb 需要采取措施避免鏈錯(cuò)配。示意圖中的小"旋鈕"和"孔"用于一般性地表示需要使用鏈轉(zhuǎn)向技術(shù)來(lái)確保 HC:HC 異二聚化和/或正確的 HC:LC 配對(duì)的位置。

       對(duì)稱(chēng)雙特異性抗體

       對(duì)稱(chēng)型 bsAb 堪稱(chēng)抗體界的 "標(biāo)準(zhǔn)款"，外形酷似 IgG，嚴(yán)格遵循 HC2LC2 的結(jié)構(gòu)套路。但別以為它就此墨守成規(guī) -- 它偷偷融合了額外的外源結(jié)合域，搖身一變成為能同時(shí)瞄準(zhǔn)兩個(gè)抗原的 "雙料選手"。

       正因如此，這些 bsAb 大多是四價(jià)的 2+2 型雙特異性抗體（每種抗原各打兩槍?zhuān)?，但若想升?jí)火力，通過(guò)雙融合還能改造成六價(jià)的 2+4 型 bsAb。要說(shuō)最常見(jiàn)的四價(jià) 2+2 型，那可就有不少成員了：scFv-IgG 融合體、DVD-Ig、串聯(lián) scFv-Fc、sdAb-IgG 融合體，還有 tetra-VH IgG（見(jiàn)圖 2），個(gè)個(gè)都是武林高手。

       對(duì)稱(chēng)型 bsAbs 的一大 "懶人福利" 就是組裝起來(lái)特別省心，只需表達(dá)一兩條不同的多肽鏈就行。這意味著跟那些需要共表達(dá)三到四條多肽鏈的非對(duì)稱(chēng) bsAbs 比起來(lái)，它在初始篩選時(shí)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例的優(yōu)化工作簡(jiǎn)直是小巫見(jiàn)大巫。而且 HC2LC2 結(jié)構(gòu)還大大降低了抗體鏈組裝出錯(cuò)的概率，純化方案自然也就簡(jiǎn)單多了。反觀(guān)非對(duì)稱(chēng) bsAbs，常常得額外加幾道純化工序，才能清除那些因組裝失誤產(chǎn)生的 "不合格產(chǎn)品"。

       不過(guò)，凡事有利有弊，HC2LC2 結(jié)構(gòu)也限制了價(jià)態(tài)的 "自由度"，因?yàn)榭乖Y(jié)合域總是成對(duì)出現(xiàn)。這就讓它在某些特殊場(chǎng)合束手束腳，比如遇到需要單價(jià)靶向以防止不良交聯(lián)的抗原（像 CD3 這種），就只能望洋興嘆了。

       在設(shè)計(jì)對(duì)稱(chēng)型 bsAbs 時(shí)，選對(duì)外源抗原結(jié)合域可是個(gè)技術(shù)活。以前大家偏愛(ài) scFv，畢竟它從常規(guī)抗體的 Fv 結(jié)構(gòu)域衍生出來(lái)很方便。但現(xiàn)在，小個(gè)子 sdAb 正憑借獨(dú)特優(yōu)勢(shì)異軍突起，成為炙手可熱的融合搭檔。它天生嬌小，還是單體，不像 scFv 那樣總愛(ài)搞 "小團(tuán)體"-- 也就是不良自組裝和聚集，實(shí)在是省心不少。

       通常會(huì)用 10-25 個(gè)氨基酸的甘氨酸 - 絲氨酸接頭來(lái)融合外源抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這家伙在水溶液里柔韌性和穩(wěn)定性都沒(méi)得說(shuō)，堪稱(chēng) "最佳粘合劑"。其他 bsAb 構(gòu)建體則另辟蹊徑，選用源自天然抗體接頭區(qū)域的接頭，比如抗體鉸鏈區(qū)，或者連接 Fv 和 CH1/Cκ 的柔性接頭。選對(duì)合適的接頭，對(duì)保證抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的正確間距和展示效果至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，接頭長(zhǎng)度還會(huì)影響 DVD-Ig 分子的抗原結(jié)合能力和穩(wěn)定性，真是差之毫厘，謬以千里。

       抗體的模塊化特性簡(jiǎn)直是設(shè)計(jì)師的福音，外源抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域既可以融合在支架多肽鏈內(nèi)部，也能接在末端，這樣就能打造出結(jié)構(gòu)五花八門(mén)的 bsAbs，完全可以根據(jù)需求量身定制。雖然這些外源抗原結(jié)合片段通常會(huì)跟全長(zhǎng) IgG 分子結(jié)合，但它們也能直接與 Fc 結(jié)構(gòu)域融合，讓構(gòu)建體比全長(zhǎng) IgG 分子小巧玲瓏，同時(shí)還能保留 Fc 區(qū)的功能，可謂一舉兩得。

       除了把獨(dú)立的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到 IgG 支架上，還有些別出心裁的策略用來(lái)開(kāi)發(fā)對(duì)稱(chēng)的 IgG 樣 bsAbs。比如四重 VH IgG，它通過(guò)把不同的結(jié)合特異性分配到 Fv 的每個(gè)可變域上（用獨(dú)立的 sdAb 替換 VH 和 VL）實(shí)現(xiàn)雙特異性。還有更絕的，把單個(gè) Fab 域的 6 個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）在空間上分成 VH 互補(bǔ)位（CDRH1、CDRL2 和 CDRH3）和 VL 互補(bǔ)位（CDRL1、CDRH2 和 CDRL3），再把這些單獨(dú)的互補(bǔ)位組合起來(lái)，就形成了稱(chēng)為 DutaFab 的單個(gè)雙特異性 Fab 域，真是把 "拆分重組" 玩得明明白白。

       非對(duì)稱(chēng)雙特異性抗體

       非對(duì)稱(chēng) BsAb 的分子幾何結(jié)構(gòu)，讓它的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)難度比對(duì)稱(chēng) BsAb 高出不少，這主要是因?yàn)椴煌贵w鏈共表達(dá)時(shí)，很容易產(chǎn)生抗體相關(guān)雜質(zhì)，就像一鍋粥里混進(jìn)了沙子，讓人頭疼。盡管有這些實(shí)際難題，非對(duì)稱(chēng) BsAb 依舊在進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)的 BsAb 類(lèi)型中占據(jù)主力位置，看來(lái)實(shí)力不容小覷。

       非對(duì)稱(chēng) BsAb 的一大顯著優(yōu)勢(shì)是，它的分子幾何結(jié)構(gòu)跟 IgG 的天然結(jié)構(gòu)長(zhǎng)得很像，這就讓它能充分利用 IgG 良好的類(lèi)藥特性，相當(dāng)于站在巨人的肩膀上。而且非對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)讓價(jià)態(tài)擁有了高度靈活性，比如能形成單價(jià)特異性（1+1），這可是對(duì)稱(chēng) bsAbs 辦不到的 "獨(dú)門(mén)絕技"。另外，那些結(jié)構(gòu)跟 IgG 分子相似度高的非對(duì)稱(chēng) bsAbs，被認(rèn)為能降低免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，這可是個(gè)大大的加分項(xiàng)。不過(guò)要說(shuō)明的是，非對(duì)稱(chēng) bsAbs 也能形成偏離嚴(yán)格二價(jià) Y 形 IgG 幾何形狀的結(jié)構(gòu)，比如三價(jià) 2+1bsAbs，真是個(gè)靈活的多面手。

       HC:HC 配對(duì)

       非對(duì)稱(chēng)雙特異性抗體（bsAb），最讓人頭疼的問(wèn)題就是多肽鏈錯(cuò)配，結(jié)果就是產(chǎn)生一堆產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，簡(jiǎn)直是生產(chǎn)路上的 "攔路虎"。許多非對(duì)稱(chēng)雙特異性抗體都得靠?jī)煞N不同重鏈（HC）的異二聚化來(lái)發(fā)揮作用，所以大家對(duì)能促進(jìn) HC 異二聚化的 HC 轉(zhuǎn)向平臺(tái)格外關(guān)注，都盼著能找到解決問(wèn)題的鑰匙。

       目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出不少 HC 轉(zhuǎn)向平臺(tái)，大多源自行業(yè)內(nèi)部，它們的工作原理是在 CH3 域中創(chuàng)建互補(bǔ)界面，而 CH3 域可是控制抗體結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵部位。不過(guò)，對(duì)結(jié)構(gòu)如此重要的 CH3 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，常常也會(huì)影響 bsAb 的熱穩(wěn)定性，真是牽一發(fā)而動(dòng)全身。

       雖然這些 CH3 轉(zhuǎn)向平臺(tái)的詳細(xì)設(shè)計(jì)原理在其他地方已有透徹的研究，但值得注意的是，這些平臺(tái)都在努力引入結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的突變，目的是讓 HC 更傾向于異二聚化，同時(shí)抑制 HC 同二聚體的形成，就像在給 HC"牽紅線(xiàn)"，讓它們按指定對(duì)象結(jié)合。

       其中，第一個(gè)被報(bào)道且應(yīng)用最廣泛的平臺(tái)是旋鈕入孔（KiH）。它的操作很有意思，在一個(gè) HC 里安插一個(gè)大個(gè)頭的色氨酸，在另一個(gè) HC 里配上空間互補(bǔ)的小個(gè)子殘基，就像鑰匙和鎖一樣嚴(yán)絲合縫。KiH 策略之所以被廣泛采用，一是因?yàn)樗谝种?HC 同型二聚體方面效果顯著（除了極少量的孔 - 孔同型二聚體），二是因?yàn)樗膶?zhuān)利已經(jīng)過(guò)期，不用再為專(zhuān)利費(fèi)發(fā)愁。這樣一來(lái)，KiH 就為構(gòu)建不對(duì)稱(chēng) bsAb 提供了一條相對(duì)輕松又免費(fèi)的路，要知道在這個(gè)領(lǐng)域競(jìng)爭(zhēng)激烈，還多由行業(yè)主導(dǎo)，其他好幾個(gè)平臺(tái)都受專(zhuān)利保護(hù)著呢，想用上可不太容易。

       在構(gòu)建用于異二聚化的 HC 時(shí)，得明白 HC 異二聚體的相對(duì)豐度其實(shí)是一種平衡狀態(tài)，并非固定不變。這種平衡會(huì)受到多種因素影響，比如相對(duì)質(zhì)粒和表達(dá)水平，通常得通過(guò)優(yōu)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率來(lái)控制。這事兒可能相當(dāng)費(fèi)時(shí)間，尤其是在表達(dá)許多不同的 bsAb 時(shí)，簡(jiǎn)直是對(duì)耐心的極大考驗(yàn)。

       比如我們最近就報(bào)道了一種不對(duì)稱(chēng) IgG/sdAb-Fc 構(gòu)建體，調(diào)整 HC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率后，兩條 HC 鏈的表達(dá)才達(dá)到最均衡的狀態(tài)，這說(shuō)明兩條 HC 可不會(huì)乖乖地平等共表達(dá)，還得靠人為調(diào)節(jié)。其他研究也發(fā)現(xiàn)，可變結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)會(huì)影響 HC 異二聚化，真是一環(huán)扣一環(huán)。

       CH1 結(jié)構(gòu)域在 IgG 分子的組裝和運(yùn)輸中扮演著重要角色，這也解釋了為什么當(dāng) Fab 結(jié)構(gòu)域被 sdAbs 或 scFvs 等片段取代后，HC 的表達(dá)行為會(huì)發(fā)生變化。有趣的是，有人通過(guò)對(duì)高表達(dá)的 λ 鏈進(jìn)行密碼子去優(yōu)化，來(lái)平衡表達(dá)量較低的 κ 鏈，居然還改進(jìn)了異二聚 κλ bsAb 的組裝，實(shí)際上提高了目標(biāo) bsAb 的產(chǎn)量，這波操作真是讓人眼前一亮。

       HC:LC 配對(duì)

       在雙特異性抗體（bsAb）的世界里，HC 和 LC 的配對(duì)就像一場(chǎng)嚴(yán)格的相親大會(huì)。選擇擁有共同 LC 的 bsAb，就好比給相親雙方定了個(gè)共同的擇偶標(biāo)準(zhǔn)，能從源頭上消除錯(cuò)配的尷尬。不過(guò)，要找到這樣的 "共同語(yǔ)言" 可沒(méi)那么容易，不僅耗時(shí)，還得在序列多樣性上做出讓步，這無(wú)疑給尋找既專(zhuān)一又深情（高親和力）的結(jié)合物增加了不少難度。

       但話(huà)說(shuō)回來(lái)，共同 LC 這種方法也不是全無(wú)好處。它只需表達(dá)三條多肽鏈，在可制造性上算是松了口氣，就像原本要準(zhǔn)備三桌飯菜，現(xiàn)在兩桌就夠了，確實(shí)省心不少。同理，找到有共同 HC 的 bsAb 也能避免 HC 錯(cuò)配的問(wèn)題，算是另一種 "捷徑"。

       其他方法則像是給 Fab 裝上了 "導(dǎo)航系統(tǒng)"，通過(guò)合理設(shè)計(jì)讓它們別走錯(cuò)路，防止在不同多肽鏈共表達(dá)時(shí)鬧 "烏龍"。比如 Crossmab、正交 Fab 界面、交換 CH1/CL 結(jié)構(gòu)域、給天然鏈間二硫鍵做 "工程改造"，還有嫁接 IgE 衍生的異二聚化結(jié)構(gòu)域，這些操作都像是給抗體配對(duì)上了多重保險(xiǎn)。

       使用兩種不同的 HC 和 LC，能讓 VH 和 VL 結(jié)構(gòu)域自由 "談戀愛(ài)"，在尋找靶向特異性 bsAb 時(shí)不受束縛，盡情展現(xiàn)多樣性?？闪硪环矫妫? 條多肽鏈要想平衡共表達(dá)，簡(jiǎn)直比讓四個(gè)性格迥異的人同時(shí)合拍地跳一支舞還難。這就需要在載體設(shè)計(jì)和生產(chǎn)克隆生成上多花心思，甚至還會(huì)給下游工藝帶來(lái)額外壓力，像是一場(chǎng)艱難的協(xié)調(diào)工作。

       當(dāng)然，也可以先讓每個(gè)抗體半單獨(dú)表達(dá)，之后再組裝成最終的 bsAb 構(gòu)建體，通過(guò)這種 "先分居后同居" 的方式得到正確的 HC:LC 配對(duì)。但這種策略就像在原本的生產(chǎn)流程中加了道 "中間商"，不僅要額外克隆生成和生產(chǎn)兩個(gè)組件，還得處理鉸鏈二硫鍵的充分還原和氧化等棘手步驟，簡(jiǎn)直是給自己找麻煩。

       還有些策略更絕，把其中一個(gè) Fab 臂換成單鏈 Fab（scFab）結(jié)構(gòu)域，讓 bsAb 只由 3 條多肽鏈組成。scFab 的柔性接頭就像個(gè)靈活的 "月老"，能促進(jìn) VH/CH1和 VL/CL 的正確配對(duì)。有意思的是，有些 Fab 域像是專(zhuān)一的 "癡情種"，天生就喜歡和同源的 HC:LC 配對(duì)；而另一些則是 "大眾情人"，在 HC:LC 配對(duì)上顯得比較隨意。研究發(fā)現(xiàn)，這種配對(duì)偏好主要由 CDR 決定，這些發(fā)現(xiàn)或許能幫我們?cè)谶x擇兼容的 HC:LC 對(duì)或?qū)ふ页Ｒ?jiàn) LC 時(shí)少走彎路。

       要是想從根本上避免 HC:LC 錯(cuò)配的問(wèn)題，還有個(gè)簡(jiǎn)單粗暴的方法：用 scFv 片段或 sdAb 等抗體片段替換一個(gè)或兩個(gè) Fab，讓 bsAb 最多只帶一個(gè) LC，這樣就從源頭上杜絕了錯(cuò)配的可能，堪稱(chēng) "釜底抽薪"。

       由于 bsAb 正確鏈配對(duì)太重要了，人們對(duì)高級(jí)分析和高效下游純化工藝的興趣也日益濃厚，畢竟得準(zhǔn)確找出并清除那些 "錯(cuò)配分子"，還得給它們定量呢。

       替代鏈轉(zhuǎn)向

       除了上面說(shuō)的組裝方法，人們還探索了一些更依賴(lài)化學(xué)處理的策略，算是 "化學(xué)媒人" 的功勞。比如表達(dá)一種 IgG 樣 bsAb，它由 4 條不同的多肽鏈組成，以單一構(gòu)建體的形式表達(dá)?？贵w鏈之間通過(guò)連接子連接，這個(gè)連接子就像個(gè) "指揮家"，控制著鏈的組裝，而且在表達(dá)后還能被去掉。給 BsAb 鏈加上亮氨酸拉鏈也能控制它們的結(jié)合，全長(zhǎng) IgG 分子還能通過(guò) SpyTag/SpyCatcher 系統(tǒng)或者點(diǎn)擊化學(xué) "牽手成功"。

       分子幾何構(gòu)形

       BsAb 可不僅僅是各個(gè)部分的簡(jiǎn)單相加，選擇最佳的分子結(jié)構(gòu)就像給房子選戶(hù)型，是獲得所需功能的關(guān)鍵設(shè)計(jì)考量。這意味著由相同分子構(gòu)建塊組成（總氨基酸含量相同），只是分子幾何形狀不同的 BsAb，可能會(huì)表現(xiàn)出天差地別的活性。

       雙重靶向通常是個(gè)復(fù)雜的活兒，因?yàn)?BsAb 的配置得同時(shí)考慮內(nèi)部和外部限制才能達(dá)到預(yù)期的治療效果。內(nèi)部限制是分子幾何形狀自身帶來(lái)的，比如結(jié)合域之間的空間位阻，就像兩個(gè)人站得太近會(huì)互相妨礙一樣。有研究檢查了一整套對(duì)稱(chēng)的 sdAb-IgG bsAb，包括鏡像特異性，發(fā)現(xiàn)抗原結(jié)合域的結(jié)合親和力會(huì)受到分子幾何結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的域間空間位阻影響，而且當(dāng) sdAb 與 LC 連接時(shí)，這種影響比與 HC連接時(shí)更明顯。不過(guò)，這種內(nèi)部限制可以通過(guò)結(jié)構(gòu)工程來(lái)緩解，比如延長(zhǎng)連接子，增加分子內(nèi)的靈活性和靶標(biāo)結(jié)合之間的距離，就像把兩個(gè)吵架的人拉開(kāi)點(diǎn)距離。

       外部限制則是由靶環(huán)境的空間組織造成的，BsAb 得擺出特定的 "姿勢(shì)" 才能實(shí)現(xiàn)所需的時(shí)空靶標(biāo)結(jié)合。對(duì)于有細(xì)胞間活性的 BsAb 來(lái)說(shuō)，這種外部限制尤為明顯，畢竟細(xì)胞表面受體的空間結(jié)構(gòu)本身就很復(fù)雜。比如，T 細(xì)胞活化所需的免疫突觸，就取決于 T 細(xì)胞抗原受體和肽 - MHC 配體的間距。既然通過(guò) T 細(xì)胞重定向 BsAb 建立的人工免疫突觸和天然免疫突觸長(zhǎng)得很像，那在設(shè)計(jì)這些 T 細(xì)胞重定向 BsAb 時(shí)，就得參考自然間距的限制，別搞 "非主流"。

       再舉個(gè)例子，當(dāng) Fynomer（源自 Fyn 激酶 SH3 結(jié)構(gòu)域的小結(jié)合蛋白）連接在 N端而不是 C 端時(shí)，F(xiàn)ynomAbs 的細(xì)胞毒活性更高。這說(shuō)明，通過(guò)調(diào)整分子幾何形狀來(lái)實(shí)現(xiàn)最佳的位間定位，效果可能出奇地好。如果短位點(diǎn)間距更有利，那基于小片段的配置或許是個(gè)不錯(cuò)的選擇。同樣，合理設(shè)計(jì)分子結(jié)構(gòu)和抗原結(jié)合域的位點(diǎn)間距，還能影響作用機(jī)理。在 T 細(xì)胞結(jié)合 scFv-IgG bsAb 中就得到了證實(shí)，將 scFv C 末端融合到 LC 上獲得的較短位點(diǎn)間距，在體外和體內(nèi)都展現(xiàn)出了更優(yōu)異的抗腫瘤效果。而且，靶向 CD19 和 CD3 的基于片段的 DART 分子，比由相同結(jié)合域組成的串聯(lián) scFv 表現(xiàn)出更好的細(xì)胞裂解作用，看來(lái) DART 分子更緊湊的 "身材" 有利于維持細(xì)胞間接觸。

       受體空間組織的重要性，讓人們開(kāi)始關(guān)注受體：抗體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析，希望能揭開(kāi)有效抗體結(jié)合的秘密，從而設(shè)計(jì)出更棒的抗體療法。其實(shí)，位間距離不僅在細(xì)胞間靶向中很重要，對(duì)于兩個(gè)表位都在同一靶細(xì)胞上的 bsAb 也同樣關(guān)鍵。比如，雙位抗 HER2 bsAb 在非活性交聯(lián)構(gòu)象中有效捕獲 HER2 的能力，就很大程度上取決于分子幾何形狀，就像用合適的網(wǎng)才能網(wǎng)住特定的魚(yú)。

       鑒于 bsAb 結(jié)構(gòu)的影響這么大，想知道哪種 bsAb 最有效，光分析親本單特異性抗體可不夠。所以，我們得努力開(kāi)發(fā)功能性篩選策略，不僅要評(píng)估親本抗體的結(jié)合能力，還得篩選組合 bsAb 組，看看哪種分子結(jié)構(gòu)和抗原結(jié)合域的組合最搭。

       而且，影響 bsAb 效力的不只是分子幾何形狀，還有特異性的相對(duì)方向。比如，把抗 HER2 scFv 與抗 PD1 IgG 支架融合，和反過(guò)來(lái)把抗 PD1 scFv 與抗 HER2IgG 融合相比，HER2 的結(jié)合率明顯降低，這說(shuō)明 "誰(shuí)站前面誰(shuí)站后面" 影響還挺大。基于片段的 bsAb 也有類(lèi)似的情況，相對(duì)方向不同，效果可能就差遠(yuǎn)了。

       在 bsAb 的設(shè)計(jì)中，不僅要優(yōu)化分子構(gòu)型和價(jià)態(tài)來(lái)達(dá)到所需的作用機(jī)制（MOA），還得優(yōu)化不同抗原結(jié)合臂之間的相對(duì)結(jié)合親和力。這可能就需要評(píng)估各種親和力變體的組合，才能找到最佳搭配，就像調(diào)配雞尾酒，比例對(duì)了味道才好。

       平衡結(jié)合親和力的重要性，讓人們對(duì)機(jī)制建模產(chǎn)生了興趣，希望通過(guò)它理解親和力相互作用，從而更科學(xué)地設(shè)計(jì) BsAb。這種親和力調(diào)節(jié)對(duì)于靶向 CD3 和腫瘤相關(guān)抗原的 T 細(xì)胞結(jié)合 BsAb 來(lái)說(shuō)尤其重要，而且相對(duì)結(jié)合親和力已經(jīng)被證明會(huì)影響療效和選擇性，可不能馬虎。

       可開(kāi)發(fā)性考慮

       可開(kāi)發(fā)性這檔子事，光讓雙特異性抗體（bsAbs）像神槍手一樣精準(zhǔn)結(jié)合抗原還不夠，它還得具備一身 "好藥相"-- 比如表達(dá)量得像打了雞血一樣飆升，穩(wěn)定性得堪比老陳醋越放越香，別動(dòng)不動(dòng)就自己抱成一團(tuán)（自交聯(lián)和聚集），溶解度也得給力不能掉鏈子。這些特質(zhì)合在一起，我們管它叫 "可開(kāi)發(fā)性特征"。就像相親前得先看看照片篩一輪，藥物開(kāi)發(fā)早期也得給 bsAbs 做個(gè)可開(kāi)發(fā)性體檢，免得辛辛苦苦砸了錢(qián)，最后發(fā)現(xiàn)這貨根本成不了臨床候選的 "潛力股"。

       現(xiàn)在大伙兒都在忙著搞計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)工具和高通量分析，想在早期就揪出那些 "先天不足" 的候選者。但問(wèn)題是，這些方法大多是給傳統(tǒng)單克隆抗體制訂的 "體檢標(biāo)準(zhǔn)"，用到 bsAbs 身上就得格外留神了 -- 畢竟給 bsAbs 搞工程改造時(shí)，很可能一不小心就捅出些意想不到的 "簍子"。比如說(shuō)，我們最近就發(fā)現(xiàn)，把單鏈抗體（sdAb）嫁接到 IgG 這個(gè) "支架" 上，表達(dá)量和穩(wěn)定性立馬就變了臉，而且變得有多離譜，全看分子的 "身材比例"、單鏈抗體接在 IgG 的哪個(gè) "部位"，還有接上去的 "零件" 數(shù)量。這研究算是把話(huà)挑明了：分子的 "顏值即正義"（最佳幾何結(jié)構(gòu)）有多重要，單鏈抗體的 "體質(zhì)" 可不能光看單個(gè)零件或者它 "爹媽"（親本抗體）怎么樣就下結(jié)論。

       bsAbs 的 "造型設(shè)計(jì)" 可能引發(fā)的其他 "健康問(wèn)題" 還不少，比如動(dòng)不動(dòng)就碎成幾段（碎片化）、特別愛(ài)扎堆（聚集傾向），還有工程改造出來(lái)的二硫鍵可能一言不合就 "鬧離婚"（還原）又 "復(fù)婚"（再氧化）。所以說(shuō)，分子的 "身材" 在化學(xué)和生物物理穩(wěn)定性這兩塊，絕 對(duì)是設(shè)計(jì)時(shí)的重中之重。

       不光如此，分子的 "穿搭風(fēng)格"（形式）還會(huì)影響 bsAbs 在體內(nèi)的 "保質(zhì)期"（藥代動(dòng)力學(xué)），大伙兒也在想辦法搞出能預(yù)測(cè)這一點(diǎn)的體外檢測(cè)方法。但架不住 bsAbs 的 "穿搭" 實(shí)在太多樣了，各種形式和 "身材" 讓人眼花繚亂，以至于到現(xiàn)在都沒(méi)法給它們的可開(kāi)發(fā)性畫(huà)個(gè)統(tǒng)一的 "標(biāo)準(zhǔn)像"。

       雖然搞大規(guī)模的系統(tǒng)研究，說(shuō)不定能總結(jié)出各種 "穿搭" 和 "身材" 的共同規(guī)律，但目前的做法通常是：要么在專(zhuān)利平臺(tái)的 "圈子里"，通過(guò)組合庫(kù)高通量篩選或者多參數(shù)優(yōu)化，找出那些 "體質(zhì)" 不錯(cuò)的 bsAbs；要么就是走 "捷徑"-- 把單個(gè)表達(dá)的抗體組分用生物偶聯(lián)的方式拼起來(lái)，不用費(fèi)勁吧啦地逐個(gè)生產(chǎn)，就能攢出一大堆 bsAbs 來(lái)篩選，這操作簡(jiǎn)直是 "搭積木式" 高效。

       要是想針對(duì)性改善 bsAbs 的 "體質(zhì)"，就得對(duì)那些 "拖后腿" 的片段下功夫優(yōu)化。比如給片段 "強(qiáng)身健體"，讓它更耐熱、更易溶、化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，也別老想著 "抱團(tuán)取暖"。但關(guān)鍵是，優(yōu)化完之后還得把它放回完整的 bsAbs 里再測(cè)一遍，免得 "單個(gè)零件給力，組裝起來(lái)掉鏈子"。

       對(duì) "藥相" 的要求也能提前融入發(fā)現(xiàn)過(guò)程，比如在篩選的時(shí)候就給 "好藥相" 設(shè)點(diǎn) "加分項(xiàng)"。

       結(jié)論

       雙特異性抗體（bsAbs）絕 對(duì)是治療界的 "潛力新星"，在各種醫(yī)療場(chǎng)景里都憋著一股狠勁想大顯身手。但這貨能不能成，全看設(shè)計(jì)和構(gòu)建夠不夠給力 -- 既得讓它治病夠猛，又得讓它的理化性質(zhì)夠乖，這平衡可得拿捏準(zhǔn)了。

       就像前面說(shuō)的，bsAbs 的 "戰(zhàn)斗力" 和 "表現(xiàn)分" 之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，全看它的 "結(jié)構(gòu)造型" 給不給力?，F(xiàn)在大伙兒都在使勁兒設(shè)計(jì)那種既能雙靶點(diǎn) "開(kāi)黑"，又能滿(mǎn)足開(kāi)發(fā)要求，甚至能超越傳統(tǒng)單特異性抗體的 bsAbs。

       這篇文章掏心窩子分享的這些見(jiàn)解，就是想說(shuō)明白 bsAbs 工程有多 "燒腦"，也想強(qiáng)調(diào)一句：想讓它的治療潛力徹底爆發(fā)，戰(zhàn)略設(shè)計(jì)這步棋必須走對(duì)。值得一提的是，我們深挖了工程策略和實(shí)際考量里的那些 "彎彎繞繞"，就是想弄清楚高效 bsAbs 設(shè)計(jì)里藏著的那些 "坑" 和 "機(jī)遇"。把這些設(shè)計(jì)原則的復(fù)雜門(mén)道捋清楚了，就能給 bsAbs 作為多功能 "治療利器" 的持續(xù)進(jìn)化添磚加瓦，也能給未來(lái)更牛的 bsAb 療法研究開(kāi)發(fā)指條明路。

       原文來(lái)源：A.V.Madsen, L.E.Pedersen, P.Kristensen, et al., Design and engineering of bispecific antibodies: insights and practical considerations. Front. Bioeng. Biotechnol., 2024.